DEMETER

-Le choix du système d'expression hétérologue ovocytaire a été fait afin de déorphaniser un maximum de récepteurs olfactifs identifiés chez l'adulte et la chenille de Spodoptera littoralis.
-Pour réaliser un screening moyen débit un robot de Two Electrode Voltage Clamp est utilisé (HiClamp, MultichanelSystem).

Afin de s'assurer de l'intégrité des plasmides pCS2+ injectés dans les ovocytes nous avons eu recours à un séquençage Sanger.

- Les ovocytes sont prélevés sur l'animal par laparotomie.
- Les ovocytes sont conservés dans un milieu salin physiologique à 16°C-18°C
- Les ovocytes sont injectés avec le matériel génétique (ADN, ARN) codant pour les protéines membranaires souhaitées.

Données de criblage obtenues

-On procède à une PCR des plasmides avec des amorces designées en amont et en aval de la zone d'insert en se basant sur les séquences communiquées par Nicolas MONTAGNE (INRA Versailles).
-Ces produits de PCR sont envoyés pour un séquençage Sanger à la plateforme de l'IGDR (Stéphane DREANO)

Criblage d'ovocytes exprimant les récepteurs olfactifs de Spodoptera littoralis

Microinjection des ovocytes avec de l'ADN SlitOR, coinjecté avec l'ADN SlitORco et un marqueur ADN GFP

Digestion enzymatique des fragments pour obtenir des ovocytes défolliculés prêts à être injectés

Prélèvement sur femelles (num lot :RRTL251011 TF5)
Date : 28/05/2018

Données de criblage obtenues pour l'ORco

Résultat séquençage en Forward

Résultat séquençage en Forward

Résultat séquençage en Forward

Résultat de séquençage en Forward

Résultat séquençage en Forward

Protoccole décrivant les différentes étapes pour microinjecter des construction ADN ou ARN dans l'ovocyte de Xénope

Protocole décrivant la pratique de l'anesthésie des femelles, la laparotomie

>Utilisation de la TaqDNA Polymérase 5,000 U/ml NEB Biolabs
Préparation du Mastermix :
pour 1 réaction = Taq Ready Mix 12,5µl
Primer F 1,25µl
Primer R 1,25µl
ADN matrice qsp 0,05µg/µl
Eau DEPC qsp 25µl
>Programme du thermocycleur :
-Heat lid 105°C
-Dénaturation initiale 95°C 5minutes
30 cycles de PCR :
-Dénaturation 94°C 30secondes
-Hybridation 54°C 45secondes
-Elongation 72°C 2minutes
-Elongation terminale 72°C 5minutes