PCR sur plasmides pCS2+_ORs

ANR Project DEMETER

Afin de s'assurer de l'intégrité des plasmides pCS2+ injectés dans les ovocytes nous avons eu recours à un séquençage Sanger.

-On procède à une PCR des plasmides avec des amorces designées en amont et en aval de la zone d'insert en se basant sur les séquences communiquées par Nicolas MONTAGNE (INRA Versailles). -Ces produits de PCR sont envoyés pour un séquençage Sanger à la plateforme de l'IGDR (Stéphane DREANO)

CGGAGCAAGCTTGATTTAGG

CTCACTAAAGGGAACAAAAGCTG

Photo du gel d'électrophorèse Dépôt : 5µl de produit de PCR, 2µl loadding buffer, 5µl H2O Migration 90V pendant 50 minutes

Utilisation de la TaqDNA Polymérase 5,000 U/ml NEB Biolabs Préparation du Mastermix : pour 1 réaction = Taq Ready Mix 12,5µl Primer F 1,25µl Primer R 1,25µl ADN matrice qsp 0,05µg/µl Eau DEPC qsp 25µl Programme du thermocycleur : -Heat lid 105°C -Dénaturation initiale 95°C 5minutes 30 cycles de PCR : -Dénaturation 94°C 30secondes -Hybridation 54°C 45secondes -Elongation 72°C 2minutes -Elongation terminale 72°C 5minutes